OBIECTIVELE GENERALE ALE PROIECTULUI URMĂRESC:

A. Potenţarea biosintezei de alcaloizi ergolinici de către noi tulpini de Claviceps purpurea obţinute prin hibridare somatică; optimizarea biotehnologiei de obţinere a alcaloizilor ergolinici;

Modalităţi (căi) de realizare a obiectivelor propuse

I. Utilizarea de modele şi tehnici adecvate pentru realizarea hibridării somatice intraspecifice a tulpinilor selectate de Claviceps purpurea prin:

· anastomoză hifală,

· fuziune de protoplaşti izolaţi de la tulpini de tip alcaloidic diferit

II. Verificarea realizării hibridării şi a stabilităţii tulpinilor parentale şi hibride, cultivate in vitro şi in vivo, prin analiza comportamentului unor:

· Parametri biochimici: nivelul total de alcaloizi (CAT), spectrul alcaloidic (T:S:P), cantitatea de acizi nucleici şi raportul ARN/ADN, determinarea formelor moleculare multiple ale fosfomonoesterazei acide şi malat-dehidrogenazei;

· Indicatori morfologici macroscopici şi microscopici (morfologia, culoarea, densitatea coloniilor, aspectul hifelor, dimensiunea conidiilor, prezenţa granulaţiilor);

· Indicatori de bioproductivitate (cantitatea de scleroţi/hectar);

· Indicatori chimici (macro- şi microelemente ale plantei-gazdă şi parazitului corespunzător), biochimici (pigmenţi asimilatori) şi parametri funcţionali (intensitatea procesului de respiraţie) la plantele de secară parazitate de tulpini parentale şi hibride, dovezi suplimentare şi indirecte ale modificării însuşirilor tulpinilor hibride comparativ cu cele parentale.

Rezultate:

· Obţinerea de tulpini de Claviceps purpurea cu potenţial de biosinteză alcaloidică ameliorat şi capabile de a produce cantităţi sporite de scleroţi/hectar;

· Obţinerea de extracte alcaloid ergolinice din noile tulpini cultivate submers testate pentru proprietăţile lor citostatice şi biopesticide

· Constatarea existenţei unui polimorfism accentuat al fenotipului fosfomenoesterazei acide şi a faptului că aceasta este codificată prin 7 loci genici, care îşi găsesc exprimare deplină doar în stadiile ontogenetice avansate şi nu la toate tulpinile

· Constatarea că malatdehidrogenaza este codificată de 4 loci, care nu au exprimare simultană

· Caracteristicile chimice, biochimice şi manifestările fiziologice ale plantelor gazdă sunt semnificativ influenţate de însuşirile tulpinilor de Claviceps purpurea, fiind evidente deosebirile determinate de prezenţa formelor hibride în comparaţie cu parentalii acestora.

B. Evidenţierea şi cuantificarea proprietăţii citostatice a unor alcaloizi ergolinici; Semnalarea şi confirmarea efectelor antimicotice şi insecticide ale unor compuşi ergolinici.

Material biologic: tulpini de Claviceps purpurea, parentale sau hibride, folosite pentru obţinerea unor noi biopreparate alcaloid-ergolinice autohtone; culturi de celule tumorale, animale (celule ascitice) şi umane (HeLa, derivate dintr-un carcinosarcom cervical uterin şi Hep-2p, provenite dintr-un carcinom laringian); animale sănătoase, purtătoare de diverse sisteme tumorale experimentale de tip solid şi ascitic (epiteliom limfotrop Guérin – T8 şi carcinosarcom Walker 256, în ambele variante).

Modele experimentale, adecvate realizării scopului propus:

· Prescreening-ul in vitro, pe culturile de celule neoplazice menţionate anterior, al diferitelor şarje de biopreparate ergolinice pentru selectarea celor cu proprietate citostatică şi/sau citotoxică.

· Screening-ul preclinic complex in vivo, multietapizat şi intercondiţionant, pe purtători de diverse linii tumorale experimentale de tip solid sau ascitic, pentru caracterizarea farmacodinamică a unor potenţiali agenţi antineoplazici de natură ergolinică.

· Evaluarea biocompatibilităţii organismului animal sănătos sau agresat de neoplasm la oncochimioterapia ergolinică pentru stabilirea gradului său de toxicitate.

· Culturile celulare ca modele utile decelării mecanismelor de acţiune la nivel celular, subcelular şi molecular implicate în exprimarea proprietăţii tumorosupresoare a biopreparatelor ergolinice.

· Aprecierea principiilor ergolinice ca agenţi potenţatori ai eficienţei chimioterapeutice a unor citostatice de referinţă, de uz clinic.

Argumentarea proprietăţii antitumorale şi potenţatoare a agenţilor ergolinici:

· Proprietatea citostatică şi/sau citotoxică in vitro a unor preparate ergolinice a fost evidenţiată şi confirmată de: inducerea unui impact proteinosintezo- şi mitoinhibitor; scăderea viabilităţii celulare; inhibarea dezvoltării culturilor celulare; reproductibilitatea acesteia; dependenţa potenţialului lor antitumoral in vitro de doza de tratamentului, ansamblul acestor aprecieri fiind consecinţa analizei comparative a unor indicatori microscopici (morfologici: prezenţa coloniilor de celule canceroase, suprafaţa şi densitatea lor, atingerea stadiului de monostrat; citometrici: număr celular total, număr celule vii, număr celule moarte); indici matematici (raportul celule vii/celule moarte, gradul de dezvoltare al culturilor celulare, teste statistice); parametrii biochimici (concentraţia proteinelor totale, dinamica proteinosintezei în decursul evoluţiei de celule tumorale, tratate sau martor).

· Evidenţierea impactului tumorosupresor in vivo, pe organisme animale purtătoare de diverse linii tumorale experimentale, al chimioterapiei cu principiile ergolinice, selectate în urma screeningului preliminar in vitro ca potenţiali agenţi antitumorali, şi confirmarea reproductibilităţii acestui efect farmacodinamic au fost asigurate de interpretarea celor două criterii ale evaluării calitative prin prisma analizei comparative a valorilor indicilor de evaluare înregistrate de noi, în primele două etape ale trialului, cu cele standard, impuse de programele screeningului preclinic folosite ca referinţă (indicatori biologici: ritmul de dezvoltare al tumorilor solide sau de tip ascitic în condiţiile tratamentului ergolinic; indicatori morfometrici: greutatea tumorală medie = G.T.M, în cazul sistemelor tumorale solide, durata medie de supravieţuire = D.M.S., în contextul tumorilor de tip ascitic; indicatori chimioterapici: %regresie tumorală medie = %R.T.M. şi respectiv %prelungirea duratei medii de supravieţuire =%P.D.M.S., în cazul tumorilor solide şi respectiv ascitice; raport T/C, în care T = G.T.M. sau D.M.S. al loturilor trate şi C = G.T.M. sau D.M.S., în cazul loturilor martor; indici matematici, ce asigură: aprecierea gradului de apropiere a valorilor G.T.M. şi D.M.S. înregistrate în cazul testărilor succesive obligatori; estimarea valorilor T/C x 100 al retestărilor; calcularea limitelor, superioare şi inferioare, ale domeniilor de variabilitate admise, pe baza formulelor T/C x 100 x 1,82 şi respectiv T/C x 100/1,82; compatibilitatea produselor T/C ale primelor două şi respectiv trei retestări succesive cu cele standard impuse de trialul preclinic; calculul statistic al rezultatelor cu ajutorul testului „t” a lui Student).

· Estimarea eficienţei chimioterapiei tumorosupresoare cu biopreparatele ergolinice în contextul a două etape, prevăzute de trialul farmacologic – ce impune: demonstrarea existenţei unei relaţii doză-efect (raportul pozitiv între gama de doze terapeutice şi eficacitatea acestora, ce permite optimizarea potenţialului antineoplazic prin manipularea experimentală a dozelor de tratament); dovedirea unui potenţial oncochimioterapic comparabil cu acel al unor citostatice standard, de uz clinic şi aprecierea unui semnificativ impact tumorosupresor pe tumori cu diferite grade de dezvoltare – reprezintă consecinţa interpretării comparative a valorilor indicilor de evaluare farmacodinamică (indicatori biologici: ritmul de dezvoltare al tumorilor solide sau de tip ascitic în condiţiile tratamentului ergolinic; indicatori morfometrici: greutatea tumorală medie = G.T.M, în cazul sistemelor tumorale solide, durata medie de supravieţuire = D.M.S., în contextul tumorilor de tip ascitic; indicatori chimioterapici: %regresie tumorală medie = %R.T.M. şi respectiv %prelungirea duratei medii de supravieţuire =%P.D.M.S., în cazul tumorilor solide şi respectiv ascitice; raport T/C, în care T = G.T.M. sau D.M.S. al loturilor trate şi C = G.T.M. sau D.M.S., în cazul loturilor martor; indici matematici, ce asigură: aprecierea gradului de apropiere a valorilor G.T.M. şi D.M.S. înregistrate în cazul testării potenţialului antitumoral al principiilor ergolinice, prin prisma valorii de referinţă impusă de programele de screening de referinţă; compararea eficienţei oncochimioterapiei ergolinice cu aceea a agenţilor oncostatici standard; calculul statistic al rezultatelor cu ajutorul testului „t” a lui Student).

· Estimarea toxicităţii biopreparatelor alcaloid-ergolinice autohtone, de natură fungică, asupra celulelor normale ale organismului animal sănătos sau agresat de neoplasm supuse tratamentului ergolinic, presupune analiza comparativă a valorilor unor indici caracteristici evaluării farmacotoxicologice preliminare (indici biologici: DL₅₀; indici morfometrici: dinamica ponderostatului; examinarea organotropică a principalelor viscere implicate major în economia generală a organismului; indici hematologici: număr mediu eritrocitar şi, respectiv, leucocitar, hematocritul, hemoglobinemia; indici biochimici plasmatici: proteinemia, albuminemia, globulinemia, raport globuline/albumine, glicemia, lacticidemia, lipemia, colesterolemia, nivelul acizilor graşi liberi; indici matematici: calculul statistic al rezultatelor cu ajutorul testului „t” a lui Student).

· Interacţiuni complexe şi specifice ale biopreparatelor alcaloid-ergolinice cu structuri membranare, subcelulare şi moleculare, ale celulelor tumorale responsabile de perturbarea unor fenomene membranare, evenimente metabolice şi procese celulare (indici biofizici: potenţial membranar de repaus; indici enzimatici: Na⁺–K⁺–ATP-aza membranară; indici biologici: permeabilitatea membranară, transport membranar activ şi pasiv; indici biochimici: proteine totale, solubile şi insolubile; glicogen, glucoză şi acid lactic; lipide totale, colesterol şi acizi graşi; ARN şi ADN; indici ai metabolismului energetic: consum de oxigen şi variaţia presiunii parţiale a acestuia).

· Analiza comparativă a valorilor indicilor de evaluare farmacologică a eficienţei antineoplazice experimentale a polichimioterapiei cu biopreparat ergolinic şi un citostatic standard, de uz clinic, prin prisma eficacităţii preclinice a monochimioterapiilor cu principii ergolinice, cu metotrexat, cu melfalan şi respectiv cu ciclofosfamidă (indicatori biologici: ritmul de dezvoltare al tumorilor solide în condiţiile tratamentului antitumoral; indicatori morfometrici: greutatea tumorală medie = G.T.M, în cazul sistemelor tumorale solide; indicatori chimioterapici: %regresie tumorală medie = %R.T.M., în cazul tumorilor solide; raport T/C, în care T = G.T.M. al loturilor trate şi C = G.T.M. în cazul loturilor martor; indici matematici, ce asigură: aprecierea gradului de apropiere a valorilor G.T.M. înregistrate în cazul testărilor succesive obligatori;; calculul statistic al rezultatelor cu ajutorul testului „t” a lui Student).

Rezultate:

· Caracterizarea in vitro, pe culturi de celule tumorale de origine animală sau umană, dintr-o gamă largă de biopreparate alcaloid-ergolinice – obţinute fie din mediul de cultivare submersă a tulpinilor parentale şi hibride de Claviceps purpurea sau din lizatele celulare clarificate – a unor potenţiali agenţi citostatici şi/sau citotoxici de natură ergolinică, pe baza impactului lor proteinosintintezoinhibitor, antiproliferativ, de scădere a viabilităţii celulelor tumorale şi de inhibare a dezvoltării culturilor, efectele dovedindu-se a fi reproductibile şi dependente de doză.

· Evaluarea calitativă preclinică a efectului farmacodinamic antitumoral al biopreparatului alcaloid-ergolinic Ergo-1, asupra dezvoltării unor sisteme tumorale experimentale de tip solid, ca urmare a evidenţierii impactului tumorosupresor şi confirmării reproductibilităţii acţiunii farmacodinamice.

· Evaluarea cantitativă preclinică a efectului farmacodinamic antineoplazic al biopreparatului ergolinic Ergo-1, în condiţiile extinderii şi aprofundării screeningului in vivo pe purtători de tumoră solidă, ca expresie a cuantificării eficienţei chimioterapeutice a agentului oncostatic Ergo-1 prin prisma: demonstrării existenţei unei relaţii doză-efect; dovedirii unei eficacităţi oncochimioterapeutice comparabilă cu aceea a unor citostatice standard, de uz clinic; aprecierii potenţialului tumorosupresor asupra tumorilor solide cu grade diferite de dezvoltare.

· Plasarea biopreparatului ergolinic Ergo-1, citostatic activ, în categoria chimioterapicelor antineoplazice cu efect toxic moderat, prin prisma: valorii DL₅₀; modificărilor minore în ponderostatul animalelor de experienţă supuse tratamentului ergolinic; hipertrofiilor sau hiperplaziilor, distrofiilor sau displaziilor modeste ale diverselor viscere, eritropeniei şi leucocitozei moderate, scăderii modeste a hemoglobinemiei şi a hematocritului; hipoproteinemiei, hipoalbunemiei, hipoglobulinemiei şi scăderii valorii subunitare a raportului albumine/globuline, hipoglicemiei şi hipolactacidemiei; hipolipemiei, hipocolesterolemiei şi scăderii acizilor graşi liberi de amplitudine moderată, este în concordanţă cu clasificarea gradului de toxicitate făcută de O.M.S.

· Aprecierea mecanismului probabil de acţiune, de tip membranotrop şi de tip metabolic, al biopreparatului oncochimioterapeutic Ergo-1, implicat în exprimarea farmacologică globală a efectului său antineoplazic, reprezintă consecinţa analizei şi interpretării comportamentului fenomenelor membranare (permeabilitate membranară, transport transmembranar activ şi pasiv, potenţial membranar de repaus, activitatea pompei electrogene de Na⁺ şi K⁺) şi proceselor metabolice (metabolism intermediar protidic, glucidic şi lipidic, biochimismul acizilor nucleici, metabolismul energetic) ale celulelor tumorale în interacţiunea lor complexă cu agentul biologic activ.

· Reducerea progresivă şi necroza uscată a tumorilor ca urmare a efectului vasoconstrictor şi a ischemiei induse de alcaloizii ergolinici din extractul bioactiv Ergo 1,injectat intratumoral.

· Caracterizarea farmacologică preclinică a biopreparatului alcaloid-ergolinic Ergo-1, ca potenţial agent antitumoral, creează premizele includerii sale în circuitul complex al trialului clinic, singurul care poate stabili semnificaţia acestuia pentru chimioterapia antineoplazică.