Etapa I / 2009

• Obţinerea, selecţia şi perpetuarea tulpinilor de Claviceps purpurea prin biotehnologii de hibridare somatica intraspecifica. Screening preliminar pentru testarea efectului citostatic 

• in cadrul etapei a fost efectuat un studiu documentar actualizat asupra speciei Claviceps purpurea, sursa de principii active cu efecte biologice multiple
• s-au obtinut un numar de 12 tulpini noi de Claviceps purpurea, cu potential optimizat de biosinteza alcaloidica, prin utilizarea unor biotehnologii de hibridare somatica parasexuala
• s-a realizat perpetuarea si selectia tulpinilor hibride obtinute, prin cultivare in regim submers, urmarindu-se exprimarea potenţialului biosintetic al acestora.
• au fost experimentate metodologii de extractie optima a compusilor biologic activi,  utilizand material biologic proaspat, liofilizat sau inghetat in azot lichid
• materialul biologic obtinut (concentrate din lichidul de cultura  si extracte miceliene brute), a fost evaluat prin indicatori biochimici: alcaloizi, acizi nucleici, proteine solubile, glucide reducatoare (monoglucide, diglucide, poliglucide solubile, poliglucide insolubile) şi lipide totale.
• extractele fungale brute au fost evaluate ulterior, in vitro, asupra efectului citostatic, prin testari pe linii celulare normale si tumorale – criteriu esenţial pentru screening-ul preliminar al tulpinilor de Claviceps purpurea producatoare de principii bioactive.
• Au fost efectuate studii documentare privind fracţionarea preliminara cu solvenţi de polaritaţi diferite (in funcţie de gradul de hidro/lipofilie) a materialului biologic cu efecte citostatice, in vederea stabilirii si optimizarii protocolului de identificare a componentelor bioactive
• rezultatele obtinute au fost comunicate la manifestari stiintifice, in tara. 

Etapa II/2009

• Caracterizarea la nivel chimic, biochimic, molecular si celular a materialului biologic de varste diferite, in vederea identificarii momentului optim de valorificare 

• cercetarile au fost continuate prin experimente menite sa identifice momentul optim, in dinamica procesului secretor, de recoltare si valorificare a extractelor brute cu potential citostatic
• a fost asigurata furnizarea materialului biologic catre parteneri, prin cultivarea submersa a tulpinilor hibride de Claviceps purpurea, liofilizarea materialului biologic si prepararea extractelor fungice brute   
• anterior testarii in vederea decelarii efectului citotoxic, extractele fungice obtinute au fost supuse caracterizarii biochimice primare, utilizand indicatorii stabiliti in etapa anterioara, pentru identificarea momentului optim de recoltare; un numar de 3 tulpini - T 1-3, T 2-1 si T 13-1 - caracterizate din punct de vedere biochimic, prezintă diferente semnificative în ceea ce priveste acumularea de alcaloizi si glucani, compusi de interes pentru experimentele de etalare a activitătii citostatice pe linii celulare tumorale, dar si în ceea ce priveste activitatea biosintetică a altor parametri - acizi nucleici, lipide, proteine, ca posibili markeri pentru stabilirea vârstei optime de cultivare.
• ulterior, extractele fungale - provenite din miceliu liofilizat si concentratele din supernatantul culturilor submerse de Claviceps purpurea – au fost testate in vitro, pe linii celulare tumorale, în vederea stabilirii efectului citostatic si citotoxic a biopreparatelor studiate în funcţie de originea tulpinilor din care au fost extrase, de vârsta tulpinii sau de provenienţa extractelor
• prescreening - ul in vitro, pe culturi de celule neoplazice HeLa, confirmă reala proprietate citostatică a biopreparatelor obţinute din tulpinile mentionate ale fungului Claviceps purpurea, aceasta fiind exprimată atat prin intensitatea crescută a impactului inhibitor asupra proteinosintezei celulare cat şi asupra dezvoltării culturilor de celule tumorale.
• in cadrul cercetărilor in vitro, efectuate, biopreparatele cu cele mai intense efecte citostatice asupra dezvoltării culturilor de celule tumorale HeLa au fost cele obţinute din tulpinile T1-3 şi T2-1, efectele semnalate fiind dependente de originea materialului biologic folosit pentru obţinerea biopreparatelor testate; biopreparatele obţinute din miceliul tulpinii T1-3 şi cele extrase din supernatantele tulpinii T2-1 au prezentat cel mai ridicat potenţial proteinosintezoinhibitor şi de diminuare a dezvoltării culturilor de celule tumorale din întreaga gamă de bioproduşi testaţi.
• cercetările vizând surprinderea momentului optim din dezvoltarea ontogenetică a fungului Claviceps purpurea, când randamentul biosintezei moleculelor bioactive este maxim, a permis aprecierea vârstelor de 4 şi 6 zile în cazul agenţilor bioactivi extraşi din miceliul tulpinii T1-3, şi vârstele de 10 şi 12 zile în cazul celor obţinuţi din supernatantele tulpinii T2-1, ca fiind caracterizate prin potenţialul bioactiv cel mai crescut.
• semnalarea impactului negativ asupra dezvoltării culturilor de celule tumorale a impus continuarea cercetărilor în direcţia investigării efectului biopreparatelor obţinute din miceliul tulpinii T1-3 şi a celor obţinute din supernatantele tulpinii T2-1 asupra procesului de proliferare celulară şi a viabilităţii celulelor tumorale. Ambele categorii de agenţi bioactivi se caracterizează printr-un impact mitoinhibitor semnificativ asupra culturilor de celule tumorale HeLa, evidenţiat de diminuarea accentuată a numărului total de celule, comparativ cu numărul total specific lotului martor; cercetările, bazate pe citometria tradiţională – metode microscopice folosite pentru determinarea numărului total de celule, de celule vii şi respectiv moarte şi vizualizate cu albastrul de tripan – asupra proliferării şi viabilităţii celulare culturilor la nivelul culturilor de celule tumorale HeLa, au fost dublate de investigări flow - citometrice, acestea reconfirmând potenţialul mitoinhibitor şi citotoxic al agenţilor cu origine miceliană sau supernatantă.
• potenţialul citostatic şi citotoxic crescut al bioproduşilor obţinuţi din miceliul tulpinii T1-3, cu vârsta de 4 şi 6 zile, poate fi explicat prin sinteza unei cantităţi semnificative de produşi exopolizaharidici, precum şi de precursori alcaloidici, stocaţi încă la nivel celular înainte de excluderea lor în mediu.
• impactul profund al agenţilor extraşi din supernatantele tulpinii T2-1 cu vârstele de 10 şi 12 zile poate fi explicat prin sinteza şi descărcarea în mediul de cultură a micromicetului Claviceps purpurea de alcaloizi ergolinici, substanţe bioactive cu potenţial antineoplazic semnificativ
• au fost elaborate si optimizate protocoalele de identificare a componentelor bioactive din materialul biologic cu efect citostatic determinat, prin fracţionarea preliminara cu solvenţi de polaritaţi diferite (in funcţie de gradul de hidro/lipofilie)
• ansamblul rezultatelor obţinute confirmă realizarea obiectivelor primelor doua etape ale proiectului, care s-au materializat prin confirmarea potenţialului citostatic şi citotoxic a biopreparatelor cu origine în microfungul Claviceps purpurea, prin stabilirea momentului optim – din dezvoltarea ontogenetică a micromicetului, când randamentul biosintezei moleculelor bioactive este maxim – de prelevare a materialului hifal sau supernatant folosit pentru separarea şi purificarea agenţilor biologic active. 

Etapa III/2010

• Optimizarea procesului de fermentatie in conditii de micropilot. Fractionarea extractelor bioactive si identificarea componentelor citostatic active prin prescreening-ul in vitro pe diferite tipuri de culturi celulare.

  • obiectivul urmarit si atins in prezenta etapa de studiu este reprezentat de optimizarea procesului de fermentatie in conditii de micropilot, fractionarea extractelor bioactive si identificarea componentelor citostatic active prin prescreening-ul in vitro pe diferite tipuri de culturi celulare.

  • protocolul experimental de cultivare si revigorare a tulpinilor de Claviceps purpurea, in vivo, s-a realizat infectia artificial a plantelor de secara, urmata de colectarea sclerotilor, reizolarea si purificarea tulpinilor, asigurandu-se materialul biologic necesar, cu capacitate biosintetica ridicata.

  • ulterior, au fost stabiliti parametrii de cultivare in conditii de micropilot in fermentatoare de 10 L Sartorius, a tulpinilor selectate. S-a determinat astfel ca aerarea joasa a mediului de cultura stimuleaza atat cresterea ciupercii cat si producerea de alcaloizi, cu un maxim de valori la 6 - 8 zile. Dimpotriva, aerarea puternica a mediului (2,5 vvm), nu a fost favorabila dezvoltarii culturii, dar a stimulat secretia proteica, cu un maxim de productie la 8 zile de fermentatie. De asemenea, nivelul aerarii mediului de cultura modifica raportul dintre continutul alcaloidic din celula, fata de cel excretat in mediu:

  • prin caracterizarea biochimica primara, in dinamica, a materialului biologic de varste diferite s-a determinat momentul optim de obtinere a extractelor potential citostatice. Evaluarea conţinutului total de alcaloizi în miceliul liofilizat al diferitelor tulpini de Claviceps purpurea evidenţiază o capacitate maximă de biosinteză a alcaloizilor ergotici la vârste cuprinse între 8 şi 12 zile, in functie de tulpina analizata. Trecerea la faza de micropilot a evidentiat o comportare biosintetica diferita ciupercii, fata de cea observata la nivel de flacon, in privinta tutoror parametrilor analizati (continut alcaloidic total, proteina totala, continut in acici nucleici, lipide, biomasa umeda, biomasa uscata). Prin analiza pattern-ului electroforetic al proteinelor fungice miceliene şi din lichidul de cultură, în dinamica procesului de biosinteză a alcaloizilor ergolinici, la 9 tulpini diferite de Claviceps purpurea, cultivate în condiţii submerse, prin metoda de separare SDS – PAGE, cu migrarea electroforetică a extractelor proteice miceliene totale (fracţii solubile şi insolubile) obţinute în gel de poliacrilamidă de concentraţie 12%, s-a relevat un profil electroforetic cu 37 benzi proteice comune identificate, cu greutate moleculară cuprinsă între 30 - 220 kDa, dar şi cu mici diferenţe în ceea ce priveşte apariţia a 1-2 benzi proteice, cu greutate moleculară mică, între tulpinile fungice. Spectrul electroforetic al proteinelor, atât cele miceliene cât şi din lichidul de cultură, diferă din punctul de vedere al densităţii benzilor proteice analizate, în cursul procesului de biosinteză, în mod deosebit la nivelul celor cu greutate moleculară mică.

  • un alt obiectiv al studiului a fost stabilirea conditiilor de conservare a materialului biologic, testandu-se metoda liofilizarii si a congelarii la -80⁰C, in scopul conservarii pe termen lung a tulpinilor valoroase de Claviceps purpurea. Rezultatele obtinute confirma superioritatea metodei de conservare prin liofilizare, comparativ cu congelarea materialului biologic.

  • aprofundarea cercetarilor asupra componentelor bioactive din extractul fungal brut s-a realizat prin fracţionarea cu solvenţi de polaritaţi diferite (in funcţie de gradul de hidro/lipofilie). Astfel, au fost separate doua fractiuni, si anume: fractiunea A, constituita in principal din glicoproteine si fractiunea B de natura alcaloidica si derivati fenolici de tip xantone. Fractiile obtinute au fost analizate in privinta activitatii lor citostatice, in vitro, pe culturi de celule HeLa.

  • evaluarea efectului farmacodinamic al biopreparatelor brute obtinute prin testare farmacologica preclinica in vivo, pe animale cu tumori spontane, a confirmat capacitatea lor tumorosupresoare. Pe animale de companie studiul a durat 16 săptămâni constatându-se reducerea în volum a ţesutului tumorizat rectal, reducerea edemului peritumoral şi delimitarea clară a tumorii faţă de ţesutul sănătos. În cazul tumorilor mamare după 7 administrări repetate săptămânal, s-a constatat reducerea în volum a tumorii mamare asupra careia s-a efectuat administrarea, reducerea edemului peritumoral, fluctuenţa tumorii şi delimitarea ei clară faţă de ţesutul sănătos din jur. Cea mai importantă constatare histopatologică este reprezentată de zonele de rarefacţie a ţesutului tumoral apărute prin degenerarea celulelor tumorale şi a stromei tumorale.

Etapa IV/2011

• Stabilirea parametrilor de cultivare in conditii de micropilot a materialului biologic. Evaluarea microbiologica, biochimica si farmacologica a calitatii materialului biologic conservat, prin testari in vitro si in vivo ale efectului farmacodinamic. Izolarea fractiunii/fractiunilor bioactive, evaluarea farmacologica preclinica in vivo a proprietatii tumorosupresoare si caracterizarea profilului chimic al fractiunilor bioactive/Elaborarea biotehnologiei de obtinere a unor produsi de uz veterinar si caracterizarea complexa a acestora.

• • interesul economic deosebit pentru obţinerea în culturi submerse de Claviceps purpurea a unor produşi activi din punct de vedere biologic a determinat interesul echipei noastre de cercetare pentru studierea unor indicatori care să furnizeze informaţii utile legate de capacitatea fungului de a le produce alcaloizi clavinici în diferite condiţii de cultivare, de extragere si purificare a acestora precum si de evaluare farmacologica preclinica in vivo, pe purtatori de diverse sisteme tumorale experimentale si clinic veterinara pe animale cu tumori spontane, a eficientei oncochimioterapiei experimentale, prin dovedirea existentei relatiei doza –efect, prin comparare cu potentialul terapeutic al unor citostatice standard. Rezultatele etapei anterioare au fost utilizate si cercetarile au fost continuate prin analizarea fractiilor biologic active.
  • rezultatele noastre sugerează că variaţia indicatorilor biochimici studiaţi (conţinut alcaloidic total, procentul alcaloizilor clavinici, conţinut de lipide totale, conţinut de ADN, conţinut de ARN) este dependentă de condiţiile de cultivare (agitare, aerare, temperatura), mediul de cultura utilizat (concentratia si tipul surselor de carbon si azot), de particularităţile fiecărei tulpini şi de vârsta culturilor de Claviceps purpurea. În condiţii micropilot, s-a observat ca tendinţa proceselor de biosinteză alcaloidică şi lipidică este de a se desfăşura în paralel, in conditiile de cultivare stabilite, precum si modificarea drastica a raportului dintre continutul alcaloidic total si cel in alcaloizi clavinici, in functie de sursele de carbon si azot utilizate.
  • extractele  miceliene brute rezultate din procesul de fermentatie, cu activitate antineoplazica dovedita, au fost supuse unui proces de fractionare chimica specifica, utilizand drept solventi cloroformul sau amestecul cloroform – alcool isopropilic (4:1, v/v). Prin cromatografie lichida de inalta performanta - HPLC cu faza inversa in amestec de eter-etanol.(80:20), in regim izocrat, in fractiile active a fost identificat un singur compus – agroclavina. 
  • testarea in vitro a proprietăţii citostatice a produsului clavinic, pe culturi de celule neoplazice umane HeLa şi HEp-2p, realizată pe modele experimentale adecvate, a permis (prin metode biochimice şi citometrice) evidenţierea şi dovedirea reproductibilităţii efectului proteinosintezo- şi mitoinhibitor, de inhibare a dezvoltării culturilor celulare la doza citostatic activă, EC50, de 5 µg/ ml, stabilirea dependenţei eficienţei farmacodinamice de doza de tratament – ce permite optimizarea limitată a eficienţei prin manipularea experimentală a dozelor de tratament (ineficientă la doza de 1µg/ ml, eficientă 50% la doza de 5,0 µg/ ml si potenţată la 10,0 µg/ ml, ajungând la peste 90%)– precum şi aprecierea potenţialului citostatic al produsului clavinic prin prisma unor citostatice standard de uz clinic (5-fluorouracil, etopozid, metotrexat si ciclofosfamida), fiind similar celui al 5 FU si superior impactului citostatic al etopozidului si metotrexatului . Evidenţierea şi cuantificarea, prin citometrie în flux continuu, a efectului noului produs clavinic asupra proliferării şi ciclului celular, asupra apoptozei celulare, precum şi asupra viabilităţii celulare, exprimată prin raportul numeric între celulele vii şi moarte, în conditiile folosirii unei game de doze inferioare, egale şi superioare dozei EC 50%, a reconfirmat acţiunea predominant citostatică şi acţiunea citotoxică a agentului bioactiv. 
  • in vivo, tratamentul zilnic, intraperitoneal al purtătorilor de tumoră Walker şi respectiv Guérin T- 8 cu produsul clavinic, în doză de 50 µg/kcorp  s-a concretizat prin inducerea unor scăderi, semnificative statistic, ale masei tumorale medii, faţă de greutatea tumorală medie martor, care au permis estimarea unor valori ale indicilor de evaluare (regresie tumorală medie, valoare T/C) a acţiunii antitumorale in vivo semnificative din punct de vedere citostatic (faţă de valorile minime impuse de programele american şi nemţesc de screening preclinic, elaborate în vederea identificării unor noi posibili agenţi antitumorali: GTM de 35% şi valoare T/C de 0,54).
  • la animale de companie, cu tumori externe, greu abordabile chirurgical, produsul a fost testat pe 10 câini cu tumori externe mamare şi rectale cu dimensiuni variabile. S-au aplicat doze saptamanale de 50 µg/kg timp de 10 săptămâni intratumoral în puncte diferite constatându-se reducerea vizibilă în dimensiuni a tumorilor externe în mare măsură şi a metastazelor de asemenea 
  • produsul clavinic obtinut este eficient in doza mai mica decât a celorlalte produse utilizate în terapia oncologică veterinară si nu are efecte secundare majore, sau reacţii secundare importante, nefrotoxicitatea şi hepatotoxicitatea fiind aproape nesesizabile, comparativ cu citostaticele utilizate in mod frecvent. 
  • produsul utilizat experimental este mai eficient în cazul administrării lui la animale faţă de chimioterapia utilizată în prezent atât datorită nefrotoxicităţii şi hepatotoxicităţii sale mult reduse, cât şi datorită reducerii vizibile a maselor tumorale externe. 

Cercetarile au fost concretizate in elaborarea unei biotehnologii de producere a unui compus bioactiv, cu utilizari veterinare, in vederea brevetarii

Titlu brevet (cerere): Preparat de tip clavinic cu actiune antitumorala, de uz veterinar si procedeu de obtinere

Autori: Craita Maria Rosu, Pincu Rotinberg, Zenovia Olteanu, Stefania Surdu, Elena Truta, Cosmin Teodor Mihai, Luminita Hritcu, Daniela Gherghel, Monica Hancianu, Anca Miron, Ana Clara Aprotosoaie, Oana Cioanca.